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Arbeitsgruppe Hartmann
 
     
 
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Forschungsschwerpunkte

Ribonuklease P

Das Enzym Ribonuklease P (RNase P), ein ubiquitäres Ribonukleoprotein-Partikel, spaltet tRNA-Primärtranskripte endonukleolytisch am 5’-Ende der tRNA-Domäne. In E. coli hat man zudem eine ganze Reihe von Nicht-tRNA-Substraten der RNase P gefunden, was darauf hindeutet, dass das Enzym allgemein noch über die tRNA-Maturierung hinausgehende Funktionen im RNA-Metabolismus besitzt. Die RNA-Untereinheit bakterieller RNase P-Enzyme ist in vitro auch in Abwesenheit der singulären Proteinuntereinheit katalytisch aktiv, in vivo ist das Protein jedoch essenziell. Die bakterielle RNase P RNA ist, abgesehen vom Ribosom, das einzige natürlicherweise in trans agierende Ribozym. Die RNase P RNAs aus Archaea, Eukarya und Organellen haben diese RNA-allein- oder Ribozym-Aktivität weitgehend verloren, was mit einer größeren Anzahl an Proteinuntereinheiten korreliert (normalerweise 4 in Archaea and 9-10 in Eukarya). Alle RNase P RNAs besitzen jedoch eine konservierte Kernstruktur, stammen also von einem gemeinsamen Vorläufer ab. Die RNase P ist somit ein interessantes Modellsystem, an dem sich der evolutionäre Übergang von einem fast reinen RNA-Enzym zu einem proteindominierten Ribonukleoprotein studieren lässt. Ein weiter Vorzug dieses Modellsystems ist die Verfügbarkeit eines einfachen in vitro-Funktionsassays (tRNA-Prozessierung). Da das Enzym zudem in vivo essenziell ist, können in vitro-Ergebnisse jederzeit mit in vivo-Phänotypen in entsprechenden bakteriellen und archaealen Mutantenstämmen korreliert werden.

Ziel unserer Forschungsaktivitäten ist das Verständnis der Struktur, Funktion, Dynamik und Evolution dieses Ribonukleoprotein-Enzyms auf molekularer Ebene). Dies beinhaltet Untersuchungen zum Spaltmechanismus, zur Enzym-Substrat-Bindung, zur Interaktion von RNA- und Proteinuntereinheiten sowie zur architektonischen und funktionellen Rolle der Proteinkomponente(n) in bakteriellen, archaealen und eukaryontischen RNase P-Enzymen. Aktuelle Schwerpunkte sind die Identifizierung und Charakterisierung der RNase P in Aquificales-Stämmen (insbesondere Aquifex aeolicus), die Untersuchung der in vivo-Funktion der RNase P in verschiedenen bakteriellen Mutantenstämmen, die Wiederherstellung archaealer RNA-Allein-Aktivität sowie die rekombinante Überexpression getaggter RNase P-Enzyme zur Isolierung funktioneller Ribonukleoproteinkomplexe für strukturelle und funktionelle Studien sowie zur Identifizierung zellulärer Komponenten, die mit der RNase P assoziieren.

Die im Bereich der RNase P-Forschung von uns verwendeten Methoden umfassen molekularbiologische und biochemische Ansätze (z. B. RNomics, Strukturprobing, RACE, Modifikationsinterferenz, Quervernetzung, Enzymkinetik, UV- und Fluoreszenzspekroskopie), genetische Studien, oder NMR zur Analyse der Metallionen-abhängigen Katalyse.


Strukturelle und funktionelle Aspekte des kleinen Riboregulators 6S RNA

6S RNA ist eine ubiquitäre nicht-codierende bakterielle RNA, die in E. coli kürzlich als wachstums­phasen­abhängiger Riboregulator der Transkription identifiziert wurde und durch Komplex­bildung mit dem RNA-Polymerase-Holoenzym dessen Funktion steuert. Aufgrund der konservierten Sekundärstruktur (Haarnadel mit interner Schleife) wurde vermutet, dass 6S RNA einen offenen Promotor nachahmt und dadurch einen kompetitiven Inhibitor der Polymerase für bestimmte Promotoren darstellt. Tatsächlich konnte gezeigt werden, dass die 6S RNA ein Templat für die RNA-Polymerase darstellt, an dem kurze Transkripte (14-22 Nukleotide) synthetisiert werden. In E. coli erhöht die 6S RNA die Überlebensfähigkeit der Zellen, indem sie die Zellen in der stationären Phase auf das Herauswachsen aus letzterer bei Wiederverfügbarkeit von Nährstoffen vorbereitet. Im Gegensatz zu den singulären 6S RNAs der meisten Bakterien exprimiert Bacillus subtilis zwei strukturell ähnliche 6S RNAs. Beide interagieren mit der „house-keeping“-Polymerase, zeigen aber deutlich verschiedene Expressionsprofile. Ziel des Projektes ist es, die strukturelle Grundlage der 6S RNA-Funktion zu analysieren, die Existenz zweier 6S RNAs in B. subtilis zu verstehen, und die 6S RNA-abhängigen Regulations­mecha­nismen zu klären. Die 3D-Struktur der 6S RNA adressieren wir in Kooperationsprojekten mit verschiedenen biophysikalischen Methoden. Für die Untersuchung der Interaktion mit der RNA-Polymerase verwenden wir biochemische und biophysikalische Techniken (z.B. RNA-Protein-Quervernetzungen). Die Rolle der 6S RNA(s) bei der Vermittlung zellulärer Stressantworten in B. subtilis untersuchen wir mittels Komplementation sowie Transkriptom- und Proteom-Analysen von 6S RNA-Einzel- und Doppeldeletions-Mutanten.


Antisense-basierte Tumortherapien:
Einsatz von therapeutischen Nukleinsäuren zur Inhibition onkogener miRNAs und Evaluation der Pim-1 Kinase als Tumortarget

Ansprechpartner: Prof. Roland K. Hartmann und Dr. Arnold Grünweller

Gruppenleiter AOR Dr. Arnold Grünweller

Dieser Bereich der AG Hartmann beschäftigt sich mit der Analyse von Mechanismen in Tumorzellen, die durch miRNAs reguliert werden und mit der Inhibition von onkogenen miRNAs durch LNA-modifizierte Antisenseoligonukleotide. Zudem evaluieren wir die onkogene Kinase Pim-1 als ein neues therapeutisches Target zur Behandlung von Tumorerkrankungen (Kooperation mit der AG Aigner, Uni Leipzig). Folgende Themenkomplexe werden momentan bearbeitet:

  1. LNA-modifizierte Antiseeds zur Inhibition von miRNAs in vitro und in vivo
  2. miR-33a Replacement Therapie zur Inhibition von Pim-1
  3. Kombinationstherapeutische Ansätze (siRNA, miR-33, Statine, niedermolekulare Inhibitoren) zur Inhibition von Pim-1
  4. Untersuchung der c-Myc und Pim-1 abhängigen Regulation des miRNA-Clusters miR-17-92
  5. Struktur und Funktion simplifizierter Nukleinsäureanaloga (Glycol Nucleic Acid) (Ansprechpartner Frau Dr. Kerstin Lange-Grünweller)
  6. Targeting von AU-reichen mRNA Destabilisierungselementen mit LNA

Mitarbeiter: Frau Maren Thomas (PhD), Dr. Kerstin Lange-Grünweller, Lara Golde (Masterstudentin) und Dennis Streng (PhD)

Detaillierte Informationen zu den einzelnen Projekten erteilen wir Ihnen gerne bei Interesse in einem persönlichen Gespräch.

Relevante Publikationen

Thomas, M. et al., (2012) PEI-complexed LNA antiseeds as miRNA inhibitors. RNA Biology Aug. 1;9(8).
Thomas, M. et al., (2012) The proto-oncogene Pim-1 is a target of miR-33a. Oncogene 31(7):918-28.
Ibrahim, AF. et al, (2011) MicroRNA replacement therapy for miR-145 and miR-33a is efficacious in a model of colon carcinoma. Cancer Res. Aug 1;71(15):5214-24.
Grünweller, A. and Hartmann, R.K. (2007) Locked nucleic acid oligonucleotides. The next generation of antisense agents? Biodrugs. 21(4):235-43.
Grünweller, A. and Hartmann, R. K. (2005) RNA interference as a gene-specific approach for molecular medicine. Curr. Med. Chem. 12(26):3143-61.
Grünweller, A. et al. (2003) Comparison of different antisense strategies in mammalien cells using locked nucleic acids, 2`-O-methyl RNA, phosphorothioates and small interfering RNA. Nucleic Acids Res. 31(12):3185-93.

Kontakt

Prof. Dr. Roland K. Hartmann / AOR Dr. Arnold Grünweller
Philipps-Universität Marburg
Institut für Pharmazeutische Chemie
Marbacher Weg 6
35037 Marburg
Tel.: +49-6421-28-25827 or -25849
E-Mail: roland.hartmann@staff / gruenwel@staff

 

 
 
 
Fb. 16 - Pharmazie

AG Hartmann, Marbacher Weg 6, Gebäude C, D-35032 Marburg
Tel. 06421 28-25553, Fax 06421 28-25854, E-Mail: huette@staff

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